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Rapporti scientifici volume 13, numero articolo: 10808 (2023) Citare questo articolo

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Il muscolo distrofico è caratterizzato da cicli di necrosi/rigenerazione, infiammazione e sviluppo fibro-adipogenico. Le colorazioni istologiche convenzionali forniscono dati topografici essenziali di questo rimodellamento, ma possono essere limitate a discriminare contesti fisiopatologici strettamente correlati. Non menzionano i cambiamenti della microarchitettura legati alla natura e alla distribuzione spaziale dei componenti dei compartimenti tissutali. Abbiamo studiato se l'autofluorescenza dei tessuti senza etichetta rivelata dalla radiazione ultravioletta profonda di sincrotrone (DUV) potesse servire come strumento aggiuntivo per monitorare il rimodellamento muscolare distrofico. Utilizzando la microscopia ad ampio campo con specifici filtri di fluorescenza a emissione e la microspettroscopia definita da un'elevata risoluzione spettrale, abbiamo analizzato campioni di cani sani e due gruppi di cani distrofici: animali naïve (gravemente colpiti) e animali trapiantati con cellule MuStem (clinicamente stabilizzati). L'analisi statistica multivariata e gli approcci di apprendimento automatico hanno dimostrato che l'autofluorescenza emessa a 420-480 nm dal muscolo bicipite femorale discrimina efficacemente tra campioni di cani sani, distrofici e trapiantati. La microspettroscopia ha mostrato che il muscolo del cane distrofico mostra un'autofluorescenza maggiore e minore dovuta rispettivamente alla reticolazione del collagene e al NADH rispetto a quella dei cani sani e trapiantati, definendo biomarcatori per valutare l'impatto del trapianto cellulare. I nostri risultati dimostrano che la radiazione DUV è un metodo sensibile e privo di etichetta per valutare lo stato istopatologico del muscolo distrofico utilizzando piccole quantità di tessuto, con potenziali applicazioni nella medicina rigenerativa.

Le distrofie muscolari (MD) sono un gruppo geneticamente eterogeneo di oltre 50 malattie neuromuscolari che coinvolgono il muscolo scheletrico. Tutti condividono debolezza e atrofia muscolare progressiva, ma variano nella presentazione clinica e nella gravità dei sintomi1,2. Sono caratterizzati da una degenerazione locale o generalizzata delle fibre muscolari1. La distrofia muscolare di Duchenne (DMD) è la malattia più comune e colpisce 1 neonato maschio su 3.500-5.5003. Questa malattia muscolare recessiva fatale legata all'X è causata da mutazioni nel gene della distrofina, che portano alla mancanza di una proteina funzionale essenziale per mantenere l'integrità delle fibre muscolari4. Ciò si traduce in una profonda interruzione dell'omeostasi tissutale caratterizzata da cambiamenti nella composizione delle fibre, aumento della variazione delle dimensioni delle fibre, centronucleazione, infiammazione e sostituzione delle fibre muscolari con tessuti fibrosi e adiposi5,6.

La caratterizzazione istologica dei cambiamenti estesi nel muscolo scheletrico distrofico fornisce importanti informazioni sulla fisiopatologia della malattia ed è uno strumento chiave utilizzato per valutare gli effetti di nuove strategie terapeutiche7. I parametri tissutali quantificabili standard, tra cui il numero di fibre, il diametro di Feret, la composizione del tipo di fibra, la percentuale di fibre centronucleate e la proporzione di fibrosi e adiposi, vengono misurati in sezioni trasversali del muscolo scheletrico colorate utilizzando tecniche di colorazione topografiche classiche come l'ematossilina-eosina -zafferano (HES), rosso Picrosirius e tricromo di Gomori e/o immunomarcatura specifica8. Tuttavia, la valutazione del rimodellamento del tessuto connettivo può talvolta essere più impegnativa: la fibrosi endomisio può essere difficile da quantificare con precisione se si considera rigorosamente l’area superficiale occupata senza integrare la disposizione del collagene all’interno della matrice extracellulare, che ha dimostrato di essere fondamentale nella funzione meccanica9. Pertanto, potrebbe non essere un criterio sufficientemente discriminante per la valutazione accurata della progressione della malattia. Allo stesso modo mancano metodi per valutare l’efficacia delle strategie terapeutiche10. Prove recenti suggeriscono che l'organizzazione della rete di collagene, e in particolare la reticolazione del collagene, costituisce un potenziale biomarcatore della DMD11,12,13. A livello funzionale, la reticolazione del collagene svolge un ruolo critico nella rigidità muscolare14,15 ed è stata analizzata utilizzando la microscopia a luce polarizzata12 e l'imaging di generazione di seconda armonica (SHG)12 in sezioni di tessuto colorate con Herovici13 e Picrosirius rosso. Recentemente abbiamo dimostrato che l'imaging SHG del tessuto eliminato è un potente approccio senza etichetta per la caratterizzazione 3D della fibrosi cardiaca nella DMD16. Inoltre, l'autofluorescenza delle bio-macromolecole in risposta alla microscopia ultravioletta profonda (DUV) di sincrotrone può costituire un utile marcatore per la caratterizzazione ultrastrutturale di diversi tessuti animali17,18,19 e per il monitoraggio della tipizzazione delle fibre muscolari e dello stato metabolico20,21.