Caratterizzazione molecolare delle vie degli elettroni mancanti per la sintesi del butanolo nel Clostridium acetobutylicum

Nature Communications volume 13, numero articolo: 4691 (2022) Citare questo articolo

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Clostridium acetobutylicum è un promettente biocatalizzatore per la produzione rinnovabile di n-butanolo. Sono già state sviluppate diverse strategie metaboliche per aumentare la resa di butanolo, il più delle volte basate sul reindirizzamento della via del carbonio. Tuttavia, è stato precedentemente dimostrato che le attività sia della ferredossina-NADP+ reduttasi che della ferredossina-NAD+ reduttasi, i cui geni codificanti rimangono sconosciuti, sono necessarie per produrre NADPH e NADH extra necessari per la sintesi del butanolo in condizioni solventogene. Qui purifichiamo, identifichiamo e caratterizziamo parzialmente le proteine ​​responsabili di entrambe le attività e dimostriamo il coinvolgimento degli enzimi identificati nella sintesi del butanolo attraverso un approccio genetico inverso. Dimostriamo inoltre che la resa della formazione di butanolo è limitata dal livello di espressione di CA_C0764, il gene che codifica la ferredossina-NADP+ reduttasi e l'operone bcd, che codifica per una ferredossina-NAD+ reduttasi. L'integrazione di questi enzimi nelle strategie di ingegneria metabolica introduce opportunità per lo sviluppo di un ceppo omobutanologenico di C. acetobutylicum.

Il Clostridium acetobutylicum è un batterio anaerobico Gram-positivo sporigeno in grado di convertire vari zuccheri e polisaccaridi in acidi organici (acetato e butirrato) e solventi (acetone, butanolo ed etanolo). Data la sua importanza nella produzione industriale dei prodotti chimici sfusi acetone e butanolo1,2,3 e il suo potenziale utilizzo nella produzione di n-butanolo, un promettente combustibile liquido a base biologica con numerosi vantaggi rispetto all’etanolo4,5, molte ricerche si sono concentrate su ( i) comprendere la regolazione della formazione di solventi6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 e (ii) ingegnerizzare metabolicamente questo microrganismo per produrre elevate rese di alcoli16,17,18.

Utilizzando un approccio di biologia del sistema globale per la caratterizzazione del metabolismo solvente di una coltura chemostatica limitata da fosfati di C. acetobutylicum, sono state precedentemente caratterizzate le sei fasi coinvolte nella conversione dell'acetil-CoA in butanolo (Fig. 1): l'enzima principale responsabile della riduzione del crotonil-CoA a butirril-CoA è stato dimostrato essere il complesso BCD (codificato da bcd, etfB ed etfA, l'operone bcd), un enzima biforcante che consuma due moli di NADH e produce una mole di ferredossina ridotta, e il complesso BCD è stato dimostrato che le ultime due fasi della produzione di butanolo sono catalizzate da AdhE1 attraverso la sua attività dell'aldeide deidrogenasi NADH-dipendente e da BdhB, BdhC e BdhA attraverso la loro attività della butanol deidrogenasi NADPH-dipendente. Questi risultati hanno avuto un forte impatto sulla distribuzione del flusso di elettroni, poiché è stato dimostrato che sia le attività della ferredossina-NADP+ reduttasi che della ferredossina-NAD+ reduttasi erano necessarie per produrre il NADPH e il NADH extra necessari per la sintesi del butanolo dall'acetil-CoA (Fig. 2) 19. Sebbene le attività di questi enzimi fossero state precedentemente rilevate in C. acetobutylicum6,20, i geni codificanti rimanevano sconosciuti19,21. Gli enzimi ferredossina-NADP+ reduttasi (FNOR) (EC 1.18.1.3) sono distribuiti su una varietà di organismi aerobici dai procarioti agli eucarioti, specialmente nelle piante22, ma non sono mai stati purificati e caratterizzati da alcuna specie di clostridi. Al contrario, la riduzione del NAD+ dipendente dalla ferredossina accoppiata all'esportazione di protoni (Rnf) e alle transidrogenasi dipendenti dalla ferredossina (Nfn) sono state caratterizzate da un punto di vista molecolare in diverse specie di clostridi ma non sono stati trovati omologhi in C. acetobutylicum23,24,25. Inoltre, è stato dimostrato che C. acetobutylicum non è in grado di produrre NADPH attraverso la via ossidativa del pentoso-fosfato, poiché mancava un gene che codifica per una glucosio-6-P deidrogenasi, il primo e chiave enzima di questa via19,26.

Il riquadro verde indica i prodotti primari in condizioni acidogene, mentre il riquadro rosso indica i prodotti primari in condizioni solventogene. Le lettere in rosso e corsivo indicano i geni corrispondenti. ack acetato chinasi, adc acetoacetato decarbossilasi, adhE1 aldeide deidrogenasi, adhE2 aldeide bifunzionale/alcol deidrogenasi, alsD alfa-acetolattato decarbossilasi, alsS acetolattato sintasi, bcd butirril-CoA deidrogenasi, bdh butanolo deidrogenasi, buk butirrato chinasi, crt crotonasi, ctf AB CoA-transferasi , etf flavoproteina di trasferimento di elettroni, hbd 3-idrossibutirril-CoA deidrogenasi, idrogenasi, fnor ferredossina-NAD(P)+ ossidoreduttasi, pdc piruvato decarbossilasi, pfor piruvato:ferredossina ossidoreduttasi, pta fosfotransacetilasi, ptb fosfotransbutirrilasi, thl tiolasi, gapC NADH- dipendente gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi, gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi gapN non fosforilante che produce NADPH, Fd ox rappresenta la ferredossina ossidata, mentre Fd rosso rappresenta la ferredossina ridotta.