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Rapporti scientifici volume 13, numero articolo: 10093 (2023) Citare questo articolo

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La definizione biologica che distingue le trappole extracellulari dei neutrofili (NET) da altre forme di morte cellulare è irrisolta e le tecniche che identificano in modo inequivocabile le NET rimangono sfuggenti. La misurazione dello scattering Raman fornisce una panoramica olistica della composizione molecolare cellulare basata sulle caratteristiche vibrazioni dei legami in componenti quali lipidi e proteine. Abbiamo raccolto spettri Raman dai NET e congelato/scongelato cellule necrotiche utilizzando una piattaforma ad alto rendimento personalizzata in grado di misurare rapidamente gli spettri da singole cellule. L'analisi delle componenti principali degli spettri Raman dei NET li distingue chiaramente dalle cellule necrotiche nonostante la loro morfologia simile, dimostrando le loro differenze molecolari fondamentali. Al contrario, le tecniche classiche utilizzate per l'analisi NET, la microscopia a immunofluorescenza, il DNA extracellulare e l'ELISA, non sono state in grado di differenziare queste cellule. Inoltre, l'analisi di apprendimento automatico degli spettri Raman ha indicato sottili differenze nei NET indotti dal lipopolisaccaride (LPS) rispetto a quelli indotti dal forbolo miristato acetato (PMA), dimostrando che la composizione molecolare dei NET varia a seconda dello stimolante utilizzato. Questo studio dimostra i benefici della microscopia Raman nel discriminare i NET da altri tipi di morte cellulare e dal loro percorso di induzione.

Le trappole extracellulari dei neutrofili (NET) sono una forma di morte cellulare caratterizzata dalla rottura del nucleo e dal rilascio di DNA in una nuvola o struttura simile a una stringa1,2. A causa della loro natura delicata e varia, lo sviluppo di tecniche specifiche e semplici per la caratterizzazione dei NET è stato difficile3,4. Sebbene un ampio numero di ricerche abbia dimostrato che la formazione di NET è una forma controllata e distinta di morte cellulare2,5, esiste una significativa sovrapposizione con altri percorsi di morte cellulare e l'esatta definizione di NET è in discussione4. La decondensazione e il rilascio del DNA distinguono i NET da processi come l'apoptosi, la necroptosi e la piroptosi, che provocano tutti una condensazione nucleare6,7. Tuttavia, le fasi successive di molti percorsi di morte cellulare possono provocare la rottura del nucleo e il rilascio del DNA, confondendo potenzialmente l'analisi degli endpoint. Ad esempio, la necrosi secondaria, che si verifica dopo l'apoptosi, provoca la decondensazione del DNA, la lisi cellulare e il rilascio di contenuti extracellulari8,9,10. Inoltre, la morte cellulare non regolata, come la necrosi causata direttamente dal danno fisiologico alle cellule, può provocare caratteristiche notevolmente simili alla formazione di NET11,12. È fondamentale distinguere questi tipi di morte cellulare per comprendere quali percorsi vengono attivati ​​per causare la morte cellulare, come possono essere controllati per mitigare potenziali esiti patologici e se la morte cellulare è il risultato di insulti fisiologici o stress alle cellule durante procedure sperimentali o costituisce un vero e proprio percorso di morte cellulare programmata6.

Il rilevamento e la quantificazione del NET si basano solitamente su una combinazione di misurazione del DNA extracellulare, morfologia cellulare e marcatori proteici, i più comuni sono mieloperossidasi (MPO), elastasi neutrofila (NE) e istoni citrullinati. La misurazione del DNA extracellulare utilizza coloranti fluorescenti, come PicoGreen2, per misurare il DNA rilasciato nel surnatante. Anche coloranti impermeabili per DNA come Sytox Green vengono spesso utilizzati per colorare i NET, escludendo le cellule con una membrana intatta, consentendo la quantificazione mediante tecniche come la citometria a flusso13,14,15. Sebbene facili da implementare, queste tecniche sono limitate a causa della loro incapacità di distinguere i NET da altre forme di morte cellulare. L'analisi morfologica migliora questo aspetto, ma richiede l'imaging seguito dal conteggio manuale o dall'elaborazione automatizzata delle immagini16,17,18,19,20. Questo può essere laborioso e introdurre errori, pertanto i marcatori proteici vengono spesso introdotti nel tentativo di migliorare la precisione. Oltre a coadiuvare le tecniche di imaging, i marcatori proteici vengono utilizzati negli ELISA sandwich, in cui i NET vengono immobilizzati utilizzando anticorpi proteici, comunemente anti-MPO, e rilevati tramite anticorpi per il DNA (o viceversa)21,22,23.